Lockheed thiết kế chiếc P-38 nhằm đáp ứng một yêu cầu của Không lực Lục quân Hoa Kỳ năm 1937 về một máy bay tiêm kích đánh chặn tầm cao, đạt tốc độ 580 km/h ở độ cao 6.100 m (360 mph ở 20.000 ft).[6] Chiếc P-39 Airacobra của hãng Bell và P-40 Warhawk của Curtiss cũng được thiết kế để đạt được những yêu cầu này.

Nhóm thiết kế Lockheed dưới sự chỉ đạo của Hall Hibbard và "Kelly" Johnson đã cân nhắc một loạt cấu hình[7] trước khi tổng hợp một số thiết kế từ những máy bay tiêm kích hiện có. Nhóm Lockheed chọn thân đôi để mang các động cơ và cánh ổn định, và một thân giữa cho phi công và vũ khí. Mũi máy bay được thiết kế để mang 2 súng máy Browning M2 12,7 mm (0,50") với 200 viên đạn mỗi khẩu, 2 súng máy Browning M1919 7,62 mm (0,30") với 500 viên đạn mỗi khẩu, và 1 pháo Oldsmobile 37 mm với 15 quả đạn. Gắn cụm toàn bộ vũ khí trên mũi có nghĩa là khác với đa số máy bay Mỹ khác gắn súng trên cánh, nơi mà đường đạn bắn chéo nhau đến nhiều điểm trong một "vùng hội tụ", phi công Lightning cần nhắm chính xác hơn. Ví dụ, phi công "Ách" Dick Bong, người có số chiến công cao nhất nước Mỹ trong Thế Chiến II, phải bay thẳng đến mục tiêu để chắc trúng, đôi khi phải bay qua những mảnh vỡ của máy bay đối phương. Tuy nhiên, súng gắn mũi không bị giới hạn tầm bắn hiệu quả do kiểu hội tụ, nên phi công giỏi có thể bắn xa hơn. Chiếc Lightning có thể bắn trúng mục tiêu trong tầm đến 1.000 yard, trong khi các kiểu tiêm kích khác phải chọn một vùng hội tụ trong khoảng giữa 100 đến 250 yard. Cụm vũ khí cũng có tác dụng "cưa nát" mục tiêu, nên máy bay cũng có thể càn quét mặt đất.

Đây là thiết kế máy bay tiêm kích đầu tiên sử dụng bộ bánh đáp 3 bánh, và được trang bị 2 động cơ 12-xi lanh Allison V-1710 1.000 mã lực (746 kW) turbo-siêu tăng áp với các cánh quạt xoay ngược nhau nhằm loại trừ tác động của mô-men xoắn động cơ, và bộ tăng áp gắn trong thân phía sau động cơ.[8]

Lockheed thắng gói thầu vào ngày 23 tháng 6 năm 1937 với kiểu Model 22, và được hợp đồng chế tạo nguyên mẫu XP-38.[9] Việc chế tạo bắt đầu từ tháng 7 năm 1938 và chiếc XP-38 cất cánh lần đầu ngày 27 tháng 1 năm 1939.[10] Chuyến bay ngày 11 tháng 2 năm 1939 để di chuyển tới nơi thử nghiệm là căn cứ Không quân Wright-Patterson được kéo dài bởi tướng Henry "Hap" Arnold, tư lệnh Không lực Bộ binh Hoa Kỳ, để thao diễn tính năng máy bay. Nó đã lập kỷ lục tốc độ bay xuyên lục địa khi bay từ California đến New York trong 7 giờ 2 phút,[8] nhưng hạ cánh hụt đường băng tại sân bay Mitchel Field, Hempstead, New York, và bị vỡ. Tuy vậy, dựa trên kỷ lục chuyến bay, Không lực đặt hàng 13 chiếc YP-38 vào ngày 27 tháng 4 năm 1939.[1]

Việc sản xuất YP-38 bị chậm trễ so với kế hoạch – chiếc đầu tiên chỉ hoàn thành vào tháng 9 năm 1940, bay lần đầu ngày 16 tháng 9-1940,[11] và chiếc cuối cùng giao cho Không lực vào tháng 6 năm 1941. Nó được thiết kế lại về căn bản và khác biệt nhiều về chi tiết so với chiếc XP-38 lắp ráp bằng tay. Nó nhẹ hơn, thay đổi cách gắn động cơ, và chiều xoay cánh quạt ngược lại (cánh quay ra từ buồng lái ở phía trên chứ không quay vào như trước) nhằm tăng độ vững của máy bay làm bệ súng.[10]

Những chuyến bay thử nghiệm cho thấy hiện tượng cánh đuôi rung là một vấn đề. Khi bay nhanh, nhất là khi bổ nhào, đuôi máy bay bắt đầu rung mạnh và mũi chúc xuống. Trong trường hợp này máy bay bị chòng chành do lực nén và các điều khiển bị khóa cứng, làm cho phi công không thể làm gì hơn là phải thoát ra bằng dù. Trong một chuyến bay ngày 4 tháng 11 năm 1940, cấu trúc đuôi bị rơi ra khi bổ nhào ở tốc độ cao; giết chết phi công thử nghiệm YP-38 Ralph Virden. Một chuyến bay khác, Thiếu tá Không lực Signa Gilkey xoay xở ở lại trong chiếc YP-38 bị khóa cứng, giữ được máy bay cho đến khi không khí đậm đặc hơn, cho đến khi thoát ra được nhờ dùng cánh nâng.[8] Khắc phục tạm thời là gắn các đối trọng trên thân giữa cánh nâng, nhưng nỗi bất hạnh thực sự được chứng minh là do sự nối kết gốc cánh đột ngột thẳng vào thân. Một vài thay đổi khí động học, đặc biệt là thêm vào đường gân ở gốc cánh, giải quyết được vấn đề trên biến thể P-38J. Dù sao, những đối trọng gắn bên ngoài là một đặc điểm của mọi P-38 được chế tạo từ đó.[12]

Johnson sau này nhớ lại: "Tôi đã phá vỡ một cái ung nhọt về hiện tượng nén trên chiếc P-38 vì chúng ta bay đến một khoảng tốc độ chưa ai bay bao giờ, và chúng tôi gặp khó khăn khi thuyết phục mọi người rằng tự nó không phải là kiểu máy bay ngộ nghỉnh, nhưng là một vấn đề vật lý căn bản. Chúng tôi khám phá điều gì xảy ra khi chiếc Lightning rớt đuôi, và chúng tôi đã làm việc trong suốt cuộc chiến để tăng thêm 15 knot (28 km/h) cho chiếc P-38. Chúng tôi thấy hiện tượng nén là một bức tường trong suốt thời gian dài, rồi chúng tôi học được cách để vượt qua nó."[13]

Một vấn đề khác của P-38 là cả hai động cơ đều rất "tối cần"; nếu một bên bị tắt, vốn hay xảy ra, tạo ra mô-men xoắn xoay máy bay lật sang bên động cơ còn hoạt động thay vì bên động cơ chết. Bài huấn luyện bay loại máy bay 2 động cơ hướng dẫn rằng: khi bị tắt 1 động cơ trong lúc cất cánh, phải tăng ga tối đa động cơ còn lại; nhưng trên P-38, mô-men xoắn tạo ra sẽ làm máy bay lộn vòng không đồng bộ không kiểm soát được, lật và rơi. Sau cùng, phi công được hướng dẫn đối phó sự cố này bằng cách giảm ga động cơ còn lại, xoay ngang cánh của cánh quạt động cơ chết, rồi tăng ga dần cho đến khi máy bay thăng bằng.

Tiếng động cơ khá độc đáo, nghe "wu wu" khá êm vì khí xả được giảm thanh bởi bộ tăng áp của General Electric cho động cơ Allison V12. Có những vấn đề về điều chỉnh nhiệt độ trong khoang lái; phi công bị quá nóng trong vùng nhiệt đới vì nóc buồng lái không thể mở ra mà không bị va đập đáng kể, và bị tê cóng khi hoạt động ở Bắc Âu vì khoảng cách giữa động cơ và khoang lái không cho phép sưởi ấm hiệu quả. Dù sao, các biến thể sau này của P-38 được cải tiến để giải quyết những vấn đề trên.

Vào ngày 20 tháng 9 năm 1939, trước khi YP-38 hoàn tất và bay thử, Không lực Lục quân Hoa Kỳ đặt hàng 66 chiếc P-38 Lightning, 30 chiếc sẽ được giao vào giữa năm 1941, nhưng không phải tất cả được trang bị vũ khí. Những chiếc không trang bị sau đó được gắn 4 súng máy 0,50" (thay cho 2 khẩu 0,50" và 2 khẩu 0,30") và 1 pháo 37 mm. Nó cũng có kính chống đạn, vỏ giáp buồng lái và các nút điều khiển buồng lái huỳnh quang.[14] Một chiếc được trang bị buồng lái điều hòa áp lực thử nghiệm và được mang ký hiệu XP-38A.[15] Căn cứ vào báo cáo Không lực nhận được từ châu Âu, 36 chiếc còn lại trong loạt này được nâng cấp với những cải tiến nhỏ như thùng nhiên liệu tự hàn kín và giáp bảo vệ được tăng cường để tăng hiệu quả chiến đấu. Không lực chỉ định 36 chiếc này mang ký hiệu P-38D (và như vậy không hề có phiên bản P-38B hay P-38C). Vai trò chính của những chiếc P-38D là tìm ra lỗi và rút kinh nghiệm vận hành kiểu máy bay này.[16]

Tháng 3 năm 1940, Pháp và Anh đặt hàng tổng cộng 667 chiếc P-38, ký hiệu Kiểu 322F cho Pháp và Kiểu 322B cho Anh. Đó là một biến thể của P-38E mà không có turbo siêu tăng áp (vì chính sách giới hạn xuất khẩu của chính quyền Mỹ), và động cơ có cánh quay về bên phải thay vì ngược chiều nhau cho giống với số lượng lớn máy bay Curtiss Tomahawk mà hai nước này đặt hàng. Sau khi Pháp sụp đổ vào tháng 6 năm 1940, phía Anh lấy toàn bộ đơn đặt hàng và đặt tên lại máy bay là Lightning I (Tia Chớp I). Ba chiếc Lightning I được giao cho Anh Quốc vào tháng 3 năm 1942, và sau khi thấy rằng, không có siêu tăng áp và sử dụng xăng có chỉ số octane thấp của Anh, nó chỉ đạt được tốc độ tối đa 480 km/h (300 mph) cũng như tính năng điều khiển kém, toàn bộ đơn đặt hàng bị hủy bỏ. 140 chiếc Lightning I còn lại được hoàn thành và giao cho Không lực Lục quân Hoa Kỳ với cánh quạt quay ngược chiều nhưng vẫn không có siêu tăng áp. Nó được chuyển cho những đơn vị huấn luyện dưới ký hiệu RP-322.[17] Những máy bay này giúp Không lực huấn luyện phi công mới bay một máy bay tiêm kích mạnh mẽ và phức tạp. RP-322 bay khá nhanh ở độ cao thấp và phù hợp để huấn luyện. Một điểm tốt trong thất bại này là tên "Lightning" được đặt cho máy bay. Lockheed ban đầu gọi nó là Atalanta theo truyền thống công ty đặt tên máy bay của họ những cái tên trong thần thoại và hình tượng thiên đàng, nhưng tên của Không lực Hoàng gia Anh đã thắng cuộc.